1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
Стрипы «гребенки» применяют для быстрого, надежного и экономичного определения чувствительности различных групп микроорганизмов к антибиотикам. В настоящее время выпускаются стрипы с 60 широко используемыми в клинической практике антибиотиками в концентрациях, соответствующих стандартным разведениям, рекомендуемым CLSI1 . Постоянно разрабатываются стрипы с новыми антибиотиками. Тест-система представляет собой градиент из 16 концентраций антибиотика. Она позволяет легко и точно определить минимальную подавляющую (ингибирующую) концентрацию препарата (МИК в мкг/мл) по отношению к изучаемому штамму, выращенному на поверхности агаровой среды, и правильно интерпретировать полученный результат.
Для определения чувствительности компания AB Biodisk Inc. запатентовала уникальных метод градиентной диффузии, известный под брэндом E-тест и получивший широкое распространение в рутинной практике2. Тест-система основана на инновационной градиентной технологии, разработанной с использованием принципа «сухой химии». Она состоит из двух стрипов, изготовленных из инертного материала и внешне напоминающих расческу, к «зубчикам» которой прикреплены диски с убывающими количествами антибиотика. В ходе стандартного опыта после контакта с агаровой средой вокруг дисков формируется градиент концентраций антибиотика. Получаемое в опыте значение МИК сопоставимо с МИК, полученной при исследовании стандартным методом серийных разведений. Для решения вопроса о целесообразности назначения препарата полученную концентрацию сопоставляют с возможными уровнями антибиотика в сыворотке крови или биологических жидкостях . С этих позиций тест-система дает не только быстрый, но и более точный результат.
ПРИНЦИП Полоска ХайКомб изготовлена из инертного материала, имеет 8 ответвлений с прикрепленными на их концах дисками размером 4 мм. На основании полоски указаны значения МИК в мкг/мл и код стрипа. Каждый диск «нагружен» возрастающими количествами антибиотика. После контакта с поверхностью агара препарат растворяется и диффундирует в агар вокруг дисков, создавая градиент концентраций, поэтому вокруг дисков формируется единая эллипсовидная зона задержки роста, сужающаяся в области низких концентраций антибиотика.
Преимущества использования стрипов ХайКомб в рутинных исследованиях, по сравнению с методом разведений в бульоне или агаре — простота и быстрота подготовки и постановки теста.
ПРИМЕНЕНИЕ
Данную технологию можно применять для определения чувствительности аэробов и анаэробов, неприхотливых и прихотливых бактерий (например, пневмококков, стрептококков, гонококков, гемофильных палочек, нейссерий). Ее можно использовать для выявления низких уровней устойчивости к антибиотикам, например пенициллинорезистентности пневмококков (PRP) или ванкомицинрезистентности энтерококков(VRE). Точное определение МИК антибиотиков имеет особое значение в терапии сепсиса, эндокардита, менингита, остеомиелита, муковисцидоза, а также в лечении иммунокомпрометированных больных.
МЕТОДИКА
Приготовление питательной среды
Для испытания быстрорастущих аэробных микроорганизмов готовят агар Мюллера–Хинтона, как при испытании на чувствительность методом Кирби–Бауэра. Для таких прихотливых бактерий, как стрептококки в среду добавляют 5% стерильной дефибринированной овечьей крови. Для тестирования Haemophilus spp. рекомендуют среду Haemophilus Test Agar Base, а для N. gonorrhoeae — основу агара GC с 1% соответствующей ростовой добавкой. Среда в чашках должна быть стерильной, толщина агарового слоя - около 4 мм.
Посев
Данный этап — один из наиболее ответственных. Рекомендуется использовать метод, позволяющий получать гомогенную суспензию испытуемого микроорганизма плотностью 1-2х108 кл/мл. Для теста используют только чистые культуры, что подтверждают предварительной микроскопией препаратов, окрашенных по Граму. В 5 мл триптон-соевого бульона проволочной петлей или иглой вносят материал из 4-5 одинаковых колоний и инкубируют бульон 2-8 ч при 35-37°С (до появления легкой или умеренной мутности). Сравнивают мутность бульона со стандартом 0,5 по МакФарланду (его готовят, как описано в разделе МАТЕРИАЛЫ) и при необходимости разводят бульон или продолжают его инкубировать. Инокулюм можно стандартизовать и другим подходящим оптическим методом (в кювете толщиной 10 мм при длине волны 620 нм оптическая плотность, соответствующая 1-2х108 кл/мл, — 0,08–0,1). Техника посева — тампоном, как при обычном диско-диффузионном методе (см. разделе МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ)
Рис. 7. Техника аппликации стрипов ХайКомб для постановки МИК-теста.
Обозначения:
A. В асептических условиях вскройте упаковку со стрипами ХайКомб
B. Стерильным пинцетом захватите один стрип за его основание
C. Уложите стрип маркировкой вверх так, чтобы более высокие концентрации были ближе к краю чашки
D. Слегка прижмите основание стрипа и убедитесь, что все диски полностью контактируют с питательной средой
E. На противоположную сторону чашки уложите другой стрип (более высокие концентрации - ближе к краю чашки)
F. Закройте чашку крышкой и проверьте, все ли диски полностью контактируют со средой (на чашку диаметром 200 мм можно укладывать по 3 A- и 3 B-стрипа)
Аппликация стрипов ХайКомб
Уложите стрип ХайКомб на поверхность агара маркировкой вверх, как показано на рисунке 7. Не передвигайте стрип после контакта с агаром.
Инкубирование
Инкубируйте чашки со стрипами при 35-37°C в течение 18-24 ч..
Примечания:
1. Перед использованием стрипы ХайКомб необходимо выдержать некоторое время при комнатной температуре или 25°С.
2. Стрипы ХайКомб следует держать за их основание (широкую часть).
3. Если стрип случайно выпал на сухую поверхность стерильного агара, его можно (при соблюдении асептики) использовать повторно.
4. Если стрип упал в неправильной позиции, оставьте его на месте и используйте для тестирования другую область чашки.
5. Сохраняйте спокойствие при укладывании стрипов. Не двигайте стрипы после того, как они коснулись агара, поскольку диффузия антибиотика начинается сразу же после их контакта с питательной средой.
6. Для прихотливых или очень чувствительных бактерий используйте не более 4-5 стрипов на чашку диаметром 150 мм или 1 стрип на чашку 90 мм.
7. Для укладывания стрипов следует использовать стерильный пинцет.
УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Формируемая зона задержки роста имеет эллипсовидную форму. На значение МИК указывает проекция зоны задержки в узкой части эллипса (как при учете Е-тестов, см. рис. 3). Если зона задержки отсутствует, это означает, что МИК превышает наибольшее значение, указанное на стрипе. Если вокруг диска с наименьшим количеством антибиотика имеется зона задержки роста — МИК менее наименьшего значения, указанного на стрипе.
Результат определения МИК по стрипам А и В не всегда может совпадать. В этих случаях при
ответе указывают большее значение МИК.
При тестировании на кровяном агаре зону гемолиза не учитывают. При определении МИК протеев не учитывают также их «роение».
В Приложениях 3-6 приведены критерии для интерпретации результатов определения чувствительности различных бактерий к антибиотикам.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Работоспособность стрипов ХайКомб следует проверять с использованием контрольных штаммов, указанных в Приложении 2.
ХРАНЕНИЕ
Тест-системы ХайКомб непродолжительное время хранят при +2-8°C. Для длительного хранения их следует держать в оригинальной упаковке при минус 20°С. При правильном хранении и обращении стрипы можно использовать в течение всего срока годности. Следите за тем, чтобы на контейнере со стрипами был указан номер партии и срок годности. Ввиду того, что стрипы должны оставаться сухими, не допускайте попадания влаги в контейнер для хранения стрипов.
ОГРАНИЧЕНИЯ ТЕСТА
С помощью стрипов ХайКомб определяют лишь значение МИК в условиях in vitro, что не всегда свидетельствует об эффективности препарата in vivo . При выборе антимикробной терапии результат теста следует учитывать, принимая во внимание и другие факторы. Ответственность за подобное решение должен принимать врач, исходя из клинического опыта ведения больных с инфекционными поражениями.
Описанные тесты дают результаты, сопоставимые со стандартизованными методами определения чувствительности. Более подробно о значении подобных тестов в различных клинических ситуациях указано в соответствующих стандартах CLSI.